使用長(zhǎng)焦距顯微鏡觀察活體樣本需兼顧高分辨率成像與樣本活性維持，核心在于??光學(xué)系統(tǒng)適配、環(huán)境控制及動(dòng)態(tài)觀察技術(shù)??的結(jié)合。以下是具體操作流程與關(guān)鍵技巧：

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??一、前期準(zhǔn)備：設(shè)備與樣本適配??

??1. 顯微鏡選擇與配置??

• ??長(zhǎng)焦距物鏡選擇??：
  • 長(zhǎng)焦距物鏡（如50×、100×長(zhǎng)工作距離物鏡，工作距離≥5 mm）可避免鏡頭與樣本接觸，適合觀察培養(yǎng)皿、微流控芯片中的活體樣本（如細(xì)胞團(tuán)、小型模式生物）。
  • 若需更高分辨率，可搭配油浸長(zhǎng)焦物鏡（但需避免油滴接觸活體樣本，通常用于固定樣本）。
• ??配套光學(xué)模塊??：
  • ??落射熒光模塊??：若樣本標(biāo)記熒光蛋白（如GFP、RFP），需配置激發(fā)濾光片、二向色鏡及發(fā)射濾光片，激發(fā)波長(zhǎng)需匹配熒光探針（如GFP激發(fā)488 nm）。
  • ??差分干涉對(duì)比（DIC）模塊??：增強(qiáng)樣本表面形貌對(duì)比度（適合觀察活體組織切片或胚胎發(fā)育）。

??2. 活體樣本制備??

• ??培養(yǎng)環(huán)境適配??：
  • 將樣本置于專用培養(yǎng)皿（如μ-Dish、Glass Bottom Dish）中，底部需平坦透明（如蓋玻片或特殊光學(xué)樹脂），避免長(zhǎng)焦物鏡因工作距離限制無(wú)法對(duì)焦。
  • 若樣本需懸?。ㄈ绨唏R魚幼體、原生動(dòng)物），使用開放式培養(yǎng)皿或微流控芯片，搭配溫濕度控制載物臺(tái)。
• ??維持活性的關(guān)鍵條件??：
  • ??溫度??：恒溫載物臺(tái)（37℃±0.5℃，哺乳動(dòng)物細(xì)胞）或環(huán)境艙（室溫~42℃可調(diào)），避免溫度波動(dòng)導(dǎo)致樣本應(yīng)激。
  • ??氣體??：密閉培養(yǎng)艙通入5% CO?（維持pH穩(wěn)定）及95%空氣（或高氧環(huán)境，如斑馬魚需21% O?）。
  • ??濕度??：載物臺(tái)覆蓋濕潤(rùn)濾紙或連接濕度控制器（相對(duì)濕度＞80%，防止樣本脫水）。

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??二、顯微鏡操作步驟??

??1. 粗調(diào)與對(duì)焦??

• ??低倍預(yù)覽定位??：
  • 先用低倍物鏡（如4×或10×）快速定位樣本區(qū)域（如細(xì)胞集群、胚胎位置），避免長(zhǎng)焦物鏡因視野窄直接搜索困難。
• ??長(zhǎng)焦物鏡切換與對(duì)焦??：
  • 轉(zhuǎn)換至長(zhǎng)焦物鏡后，通過粗調(diào)螺旋將物鏡降至接近樣本（注意工作距離，避免碰撞），再逐步微調(diào)聚焦旋鈕至圖像清晰。
  • ??技巧??：活體樣本易移動(dòng)，可先暫停培養(yǎng)液流動(dòng)（如關(guān)閉微流控泵）或降低溫度（短暫至30℃）減少漂移，完成對(duì)焦后再恢復(fù)環(huán)境。

??2. 動(dòng)態(tài)觀察參數(shù)設(shè)置??

• ??曝光與增益控制??：
  • 降低熒光激發(fā)光強(qiáng)度（如LED光源調(diào)至50%~70%功率），減少光毒性；延長(zhǎng)曝光時(shí)間（如100~500 ms）或提高相機(jī)增益（但需平衡信噪比）。
  • ??活體樣本專用模式??：?jiǎn)⒂?ldquo;低光毒性成像”模式（部分顯微鏡軟件內(nèi)置），自動(dòng)優(yōu)化光源脈沖頻率與強(qiáng)度。
• ??時(shí)間序列成像??：
  • 設(shè)置間隔拍攝（如每30秒1幀，持續(xù)1小時(shí)），記錄細(xì)胞遷移、分裂等動(dòng)態(tài)過程；若樣本移動(dòng)快（如斑馬魚心跳），可提高幀率（10~30 fps）并縮小視野范圍。

??3. 環(huán)境穩(wěn)定性維持??

• ??防震與抗干擾??：
  • 將顯微鏡置于防震臺(tái)（尤其共聚焦或高分辨率模式），避免人員走動(dòng)或設(shè)備振動(dòng)導(dǎo)致圖像模糊。
  • 關(guān)閉室內(nèi)強(qiáng)光（減少環(huán)境光干擾），關(guān)閉空調(diào)直吹載物臺(tái)（避免氣流擾動(dòng)樣本）。

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??三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)??

??1. 光毒性管理??

• ??減少激發(fā)光暴露??：
  • 使用窄帶濾光片（如GFP激發(fā)帶通470/40 nm）提高光效率，降低總光照強(qiáng)度；
  • 采用間歇成像（如每觀察5幀暫停10秒），避免連續(xù)光照導(dǎo)致活性氧積累。
• ??樣本狀態(tài)監(jiān)測(cè)??：
  • 實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)（如胞膜完整性、線粒體分布），若出現(xiàn)腫脹、碎片化等損傷跡象，立即停止成像或降低光照強(qiáng)度。

??2. 焦面漂移補(bǔ)償??

• ??硬件解決方案??：
  • 配置自動(dòng)對(duì)焦模塊（如電動(dòng)Z軸步進(jìn)電機(jī)），每隔一定時(shí)間（如1分鐘）重新校準(zhǔn)焦平面；
  • 使用抗漂移載物臺(tái)（如壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)平臺(tái)），補(bǔ)償樣本因溫度變化或培養(yǎng)液流動(dòng)導(dǎo)致的位移。
• ??軟件算法輔助??：
  • 啟用“實(shí)時(shí)焦面追蹤”功能（部分顯微鏡軟件支持），通過檢測(cè)樣本邊緣或熒光標(biāo)記點(diǎn)自動(dòng)調(diào)整焦距。

??3. 樣本污染風(fēng)險(xiǎn)控制??

• ??避免介質(zhì)蒸發(fā)??：
  • 培養(yǎng)皿加蓋透氣膜（如聚四氟乙烯膜），或使用密封式微流控芯片，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)導(dǎo)致鹽濃度升高。
• ??清潔鏡頭與載物臺(tái)??：
  • 觀察結(jié)束后，用無(wú)水乙醇擦拭物鏡前端（避免殘留培養(yǎng)液腐蝕鏡片），載物臺(tái)用75%乙醇消毒（尤其接觸過病原體樣本后）。

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??四、常見問題與解決方案??

??問題現(xiàn)象??	??可能原因??	??解決方案??
圖像模糊（非對(duì)焦問題）	樣本移動(dòng)過快、環(huán)境振動(dòng)	降低培養(yǎng)液流速、啟用防震臺(tái)、縮短曝光時(shí)間
熒光信號(hào)弱	激發(fā)光強(qiáng)度不足、濾光片匹配錯(cuò)誤	提高LED功率（≤70%）、檢查濾光片組波長(zhǎng)匹配性
樣本快速死亡	溫度/CO?波動(dòng)、光毒性過強(qiáng)	檢查恒溫系統(tǒng)、通入氣體流量、降低光照頻率
焦面漂移嚴(yán)重	載物臺(tái)熱膨脹、樣本形變	啟用自動(dòng)對(duì)焦、改用抗漂移載物臺(tái)

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??五、總結(jié)??

長(zhǎng)焦距顯微鏡觀察活體樣本的核心是??平衡分辨率與樣本活性??：通過長(zhǎng)工作距離物鏡減少物理干擾，結(jié)合恒溫、恒濕、低光毒性成像技術(shù)維持樣本生理狀態(tài)，并利用動(dòng)態(tài)對(duì)焦與時(shí)間序列成像捕捉活體過程。操作中需嚴(yán)格控光、控溫、防震，針對(duì)不同樣本特性（如細(xì)胞、小型生物、組織）靈活調(diào)整參數(shù)，才能實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量、低損傷的活體成像。